Proyecto H2020 GeminiDECODER: Aislamiento y caracterización de pares móviles sRNA/diana en plantas utilizando una proteína viral como sonda
- Tipo Proyecto
- Estado Completado
- Ejecución 2020 -2023
- Presupuesto asignado 237.065,28 €
- Alcance Europeo
- Comunidad Autónoma Andalucía
- Principal fuente de financiación Horizonte 2020
- Sitio web del proyecto https://doi.org/10.3030/896910
Los pequeños ARN reguladores (ARNs) son ubicuos en las plantas. Desempeñan un papel fundamental en la "propagación" a través de una planta de ARN de interferencia (ARNi), un sistema regulador genético que actúa para silenciar la actividad de genes específicos. Dada la diversidad de ARNs y sus dianas, y combinada con su movilidad, ha sido un reto identificar y caracterizar completamente los pares de ARNs móviles y sus dianas. El proyecto GeminiDECODER, financiado con fondos europeos, está utilizando una nueva sonda para hacerlo con una resolución sin precedentes: una proteína de un virus vegetal que recientemente se ha demostrado que afecta a la propagación del ARNi de célula a célula. Promete ayudar a los científicos a aislar los ARNs móviles y sus objetivos en diferentes condiciones en diferentes plantas, con potencial aplicación en la regulación de la productividad de los cultivos. Este proyecto ha permitido el aislamiento y caracterización de sRNAs móviles y sus potenciales dianas, de forma masiva y con una resolución sin precedentes, mediante un enfoque completamente nuevo que superó limitaciones tradicionales como la falta de especificidad, la letalidad cuando se utilizan plantas mutantes o la contaminación de la muestra.
En este trabajo se ha presentado un análisis comparativo de las eficiencias de algunas de estas VSRs, cuando se utilizan como sondas virales, y las evidencias que señalan a C4 de TYLCV como la sonda viral más eficiente. Mediante el uso de C4, se han demostrado proteínas implicadas en la regulación del movimiento de célula a célula de los ARNs, y se ha caracterizado su implicación en procesos biológicos clave, como el patrón del xilema de la raíz. Se han generado listas de pares candidatos de ARNs/diana móviles, lo que abre vías para la selección de pares putativos para una mayor caracterización biológica. Además, los experimentos con los mutantes C4 generados en este proyecto han demostrado que los síntomas inducidos durante la infección podrían representar una estrategia que los virus despliegan para atraer al insecto vector, aumentando así la dispersión viral entre las plantas: este factor debe tenerse en cuenta para el manejo de plagas. -Impacto e implicaciones sociales más amplias. Debido a que el ARNi se encuentra en las bases de la mayoría de los mecanismos reguladores de las plantas, como los involucrados en el crecimiento de las plantas y las respuestas de defensa, la investigación sobre este tema puede abrir nuevas vías para el diseño de cultivos más productivos y resistentes, simplemente aprovechando los mecanismos reguladores endógenos de la planta, sin introducir elementos extraños ni utilizar la transgénesis. Este tema es primordial para una población mundial en constante crecimiento, cuando la producción de cultivos debe optimizarse y llevarse a cabo de manera ecológica y sostenible.
Las VSR son proteínas virales que evolucionaron de forma natural para superar al ARNi a diferentes niveles, incluido el movimiento del ARNs. En los últimos años, se demostró que una nueva VSR, la proteína C4 del virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCV), interfiere específicamente con el movimiento de célula a célula del ARNi. Las plantas transgénicas que acumulan artificialmente la proteína C4, es decir, las plantas que expresan C4, se generaron por transgénesis. Debido a que C4 interfiere con el movimiento de los ARNs, su presencia en las plantas que expresan C4 interferirá con el movimiento de los ARNs móviles endógenos.
Eso significa que los ARNs móviles ya no alcanzarán sus localizaciones habituales dentro de estas plantas (no pueden moverse correctamente), y los ARN que marcan para su degradación ya no se degradarán. Esto también significa que, si se encuentra que la acumulación de ARN específicos en las plantas que expresan C4 aumenta en comparación con la de las plantas de tipo silvestre, estas especies de ARN pueden considerarse como ARN móviles putativos. Siguiendo este enfoque experimental, se analizaron los niveles de acumulación de diferentes especies de ARN mediante secuenciación masiva de ARN tanto en plantas que expresan C4 como en plantas de tipo silvestre: estas secuenciaciones de ARN proporcionan información tanto de la acumulación como de la identidad (secuencia) del ARN específico. Cabe destacar que el ARNi constituye el principal mecanismo de defensa que las plantas despliegan contra patógenos como los virus, donde los ARNs complementarios se dirigen a la degradación/represión de los ARN derivados del virus.
Con el fin de aislar estas especies móviles de ARNs, se han llevado a cabo análisis combinando diferentes enfoques, como combinaciones de injerto y complementación con tomates transgénicos, que implican el uso de virus TYLCV mutantes. -Visión general de los resultados, explotación y difusión: Mediante el uso de C4 como sonda, se expusieron por primera vez las proteínas responsables de controlar el movimiento de célula a célula de los sRNAs, BARELY ANY MERSITEM 1/2 (BAM1/2). Las BAM1/2 son proteínas localizadas en la membrana plasmática, que se pueden encontrar asociadas a estructuras conocidas como plasmodesmos (canales delimitados por la membrana plasmática que comunican una célula entre sí, creando un continuo plasmático). A partir de esta localización, BAM1/2 controla el tráfico de célula a célula de ARNs móviles, y C4 interfiere con su movimiento al interactuar directamente con BAM1/2. La manipulación de estos BAM1/2 surge entonces como una poderosa técnica para manipular el movimiento de estas especies móviles.
El C4 también ha mejorado mucho como sonda viral. Un inconveniente que presenta el C4 original es que, cuando se expresa transgénicamente en las plantas, induce fuertes fenotipos de desarrollo, lo que interfiere con el aislamiento de posibles ARNs móviles. Se generaron diferentes mutanes C4 que aún son capaces de interferir con el movimiento de los ARNs pero incapaces de inducir fenotipos de desarrollo. Con la generación de estas formas mutantes C4, no solo se pusieron a disposición nuevas herramientas biotecnológicas, sino que también se descubrieron aspectos clave de la interacción molecular entre TYLCV-tomate, a saber:
- La inducción de síntomas se basa en C4.
- Se ha demostrado que los síntomas virales sirven como atrayentes para el insecto vector de TYLCV, la mosca blanca Bemisia tabaci, probablemente contribuyendo a la dispersión del virus.
Ambos aspectos contribuirán a diseñar de manera eficiente estrategias destinadas al control de plagas. Aunque la investigación aún está en curso, estos hallazgos se han puesto a disposición del público en revistas internacionales, como PNAS (Fan, Aguilar et al., 2021), New Phytologist (Aguilar y Lozano-Duran, 2022) y Stress Biology (Aguilar y Lozano-Duran, 2022), que se pueden encontrar en el repositorio público de la UE Zenodo.
La regulación de la expresión génica es clave en los organismos vivos, permitiendo respuestas tanto a estímulos internos como externos, modulando las respuestas de crecimiento, desarrollo o defensa frente a patógenos atacantes. Al controlar la expresión génica, el organismo vivo altera la acumulación de proteínas específicas en la célula, promoviendo algunas funciones e inhibiendo otras, de tal manera que el equilibrio (homeostasis) se mantiene alejado de posibles perturbaciones.
Dado que la expresión de una proteína de un gen depende de una molécula de ARN que actúa como intermediario, dirigirse a este ARN intermedio para su degradación constituye una forma importante de lograr la expresión génica de una manera muy sofisticada y específica: este mecanismo es el llamado silenciamiento del ARN (ARNi). En el ARNi, un pequeño ARN (ARNs) actúa como el elemento central de este mecanismo, dirigiéndose a la degradación de otra molécula complementaria del ARN (el ARN "intermediario"). En las plantas, estos ARNs se han caracterizado como moléculas móviles capaces de propagar el ARNi célula a célula, más allá de los sitios de iniciación, actuando así como un proceso celular no autónomo.
A pesar de su importancia capital para la biología de las plantas, el número de pares móviles de ARNs/ARN diana completamente caracterizados es escaso, debido a su naturaleza elusiva y a la baja sensibilidad de los enfoques tradicionales seguidos hasta ahora. El objetivo general de este proyecto de investigación ha sido el aislamiento y la caracterización biológica de los ARNs móviles y sus potenciales ARNs diana, siguiendo un enfoque completamente nuevo basado en el uso de supresores virales de silenciamiento de ARN (VSRs) como sondas.
Conclusiones de la acción: Una proteína viral, la proteína C4 del virus del rizado amarillo de la hoja del tomate (TYLCV), se ha caracterizado como la sonda más adecuada para el aislamiento de sRNAs móviles, de forma masiva y con mejor resolución. De este modo, se dispone de nuevas especies móviles de ARNs para su caracterización biológica y se han expuesto elementos genéticos responsables de regular su movimiento. Estos hallazgos abren la posibilidad de aumentar la resiliencia y la producción de los cultivos solo a través de la explotación de los mecanismos reguladores endógenos de la planta.
En las plantas, la interferencia de ARN (ARNi) participa en procesos que abarcan desde el desarrollo hasta las respuestas al estrés. El elemento central de este mecanismo regulador, el ARN pequeño (ARNp), se ha caracterizado como una molécula móvil capaz de propagar la ARNi más allá de los sitios de iniciación, actuando como un proceso celular no autónomo. Se conocen ejemplos de ARNp móviles: ARNp móviles de interferencia (ARNip), derivados de virus que se propagan por la planta y son responsables de la activación del silenciamiento viral en tejidos no infectados; se ha descrito que otros ARNp, junto con los microARN (miARN), se desplazan a través de diferentes capas celulares, actuando como morfógenos; finalmente, se ha demostrado que algunos miARN se desplazan a través de la vasculatura en condiciones de estrés, activando respuestas protectoras.
Por lo tanto, los ARNp móviles son de vital importancia para la biología vegetal, y se han seguido diversos enfoques para analizarlos; sin embargo, el número de pares ARNp móviles/diana completamente caracterizados es escaso. Recientemente, se ha demostrado que la proteína C4 del virus del rizado amarillo del tomate (TYLCV) interfiere específicamente con el movimiento intercelular del ARNi, sin afectar la acumulación ni la actividad de los ARN pequeños. En este proyecto, C4 se utilizará como una herramienta novedosa y potente para aislar ARN pequeños móviles y sus dianas, en diferentes condiciones (infección basal vs. viral) y en diferentes plantas (Arabidopsis y tomate), a gran escala y con una resolución sin precedentes. Mediante el uso de plantas que expresan C4, se espera detectar fácilmente ARN pequeños móviles fuera de su ubicación, así como mayores niveles de sus dianas no procesadas.
Gracias a esta sonda viral, se obtendrá una imagen completa de las diferentes poblaciones de ARN pequeños móviles y sus dianas, y se evaluará la relevancia biológica de los candidatos más destacados. Como resultado, se obtendrá nuevo conocimiento relevante sobre la regulación de procesos biológicos clave en plantas, lo que podría abrir nuevas vías para el diseño de cultivos más productivos.
ARN pequeños(Se abre en una ventana nueva) (sRNAs) son moléculas que se encuentran dentro de las plantas y que están involucradas en prácticamente todos los procesos regulatorios. Controlan las respuestas a los estímulos internos y externos, por ejemplo, y modulan el crecimiento. También desempeñan un papel fundamental en la propagación a través de una planta de Interferencia de ARN(Se abre en una ventana nueva) (ARNi), un sistema regulador genético que actúa para silenciar la actividad de genes específicos. «Los ARNs son moléculas móviles», explica el coordinador del proyecto GeminiDECODER, Eduardo Bejarano, de la Instituto de Horticultura Mediterránea y Subtropical 'La Mayora'(Se abre en una ventana nueva) en España. "Su movilidad, y diversidad, ha hecho que sea difícil identificarlos y caracterizarlos completamente, así como sus posibles objetivos de ARN".
Estos desafíos han limitado nuestra comprensión de varios procesos importantes de la planta; Por ejemplo, cómo las respuestas locales de las plantas se transforman en sistémicas. Este proceso es clave para activar las defensas de las plantas contra la privación de nutrientes o agua, o las enfermedades. Sondas de proteínas derivadas de virus vegetales El proyecto GeminiDECODER, que contó con el apoyo de la Acciones Marie Sklodowska-Curie, programa y coordinado por el Universidad de Málaga.
En España, se buscó desarrollar nuevas formas de aislar y caracterizar estos ARNs móviles y sus potenciales ARNs diana. "Para hacer esto, seguimos un enfoque completamente nuevo: usar proteínas derivadas de virus de plantas como sondas para detectar ARNs con una resolución sin precedentes", explica Bejarano. Esta técnica, cree Bejarano, podría ayudar a los científicos a aislar mejor los ARNs móviles y sus dianas en diferentes plantas, y podría tener aplicaciones potenciales en la regulación de la productividad de los cultivos. Papel de las proteínas en los procesos de desarrollo Para lograr estos objetivos, el proyecto transfirió plantas genéticamente para que acumularan una proteína viral llamada C4. Se seleccionó la proteína del virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCV, Geminivirus), debido a su capacidad para interferir con el movimiento de los ARNs. "La presencia de C4 en las plantas interfiere con el movimiento de los ARNs móviles", añade Bejarano. "Esto significa que los ARNs móviles ya no pueden alcanzar sus ubicaciones habituales, y los ARN marcados para la degradación ya no serán silenciados".
A través del análisis de los niveles anormales de acumulación de ARN, Bejarano pudo identificar posibles dianas de ARN para los ARNs móviles. También pudo recopilar información sobre la identidad del ARNs móvil específico en cuestión. Una vez identificados estos genes diana, Bejarano pudo analizar su función biológica. "Como prueba de concepto, aplicamos C4 para analizar el patrón del tejido radicular determinado por los ARNs móviles", dice Bejarano. "Esto nos permitió exponer el papel que juegan ciertas proteínas vegetales en la promoción del movimiento del ARNs y en el control de los procesos de desarrollo en las plantas". Optimización de la producción de cultivos sostenibles GeminiDECODER ha realizado varios descubrimientos importantes mediante el uso de C4 como una posible sonda móvil de ARNs. Se han aislado nuevos pares putativos de ARNs móviles/diana a la espera de confirmación y caracterización biológica. "El ARNi es fundamental para la mayoría de los mecanismos reguladores de las plantas", señala Bejarano. "Por lo tanto, este proyecto podría ayudar a abrir nuevas vías de investigación". A nivel práctico, la identificación de plantas en la naturaleza que expresan niveles más altos o más bajos de un ARNs específico podría ayudar a explicar por qué podrían exhibir una mayor resistencia contra patógenos, sequía o inanición de nutrientes. "Este tema es primordial para una población mundial en constante crecimiento, cuando la producción de cultivos debe optimizarse y llevarse a cabo de manera ecológica y sostenible", dice Bejarano.
- UNIVERSIDAD DE MALAGA
- SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES
- Ficha del proyecto CORDIS (pdf)
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