H2020 GeminiDECODER Proiektua: Landareetan sRNA/helburu bikote mugikorren isolamendua eta karakterizazioa, birus-proteina bat zunda gisa erabiliz.
- Mota Proiektua
- Egoera Bete
- Exekuzioa 2020 -2023
- Esleitutako Aurrekontua 237.065,28 €
- Eremua Europeo
- Autonomia-erkidegoa Andalucía
- Finantza-iturri nagusia Horizonte 2020
- Proiektuaren webgunea https://doi.org/10.3030/896910
RNA erregulatzaile txikiak (sRNA) nonahi daude landareetan. Zeregin kritikoa dute RNA interferentziaren (RNAi) "hedapenean" landare osoan zehar, hau da, gene espezifikoen jarduera isilarazteko balio duen erregulazio-sistema genetiko bat. RNAen eta haien jomugen aniztasuna eta mugikortasuna kontuan hartuta, erronka handia izan da RNA bikote mugikorrak eta haien jomugak guztiz identifikatzea eta karakterizatzea. EBk finantzatutako GeminiDECODER proiektuak zunda berri bat erabiltzen ari da horretarako, bereizmen paregabearekin: landare-birus bateko proteina bat, duela gutxi zelula arteko RNAi hedapena eragiten duela frogatu dena. Zientzialariei RNA mugikorrak eta haien jomugak landare desberdinetan baldintza desberdinetan isolatzen lagunduko diela agintzen du, laboreen produktibitatea erregulatzeko aplikazio potentziala izanik. Proiektu honek sRNA mugikorren eta haien jomuga potentzialen isolamendua eta karakterizazioa ahalbidetu du, eskala masiboan eta bereizmen paregabearekin, espezifikotasun eza, landare mutanteak erabiltzean hilgarritasuna eta laginen kutsadura bezalako muga tradizionalak gainditu dituen ikuspegi guztiz berria erabiliz.
Lan honek VSR horietako batzuen eraginkortasunaren analisi konparatiboa aurkezten du, birus-zunda gisa erabiltzen direnean, eta ebidentziak TYLCV C4 dela adierazten du birus-zunda eraginkorrena dela. C4 erabiliz, RNAren zelula arteko mugimendua erregulatzen parte hartzen duten proteinak frogatu dira, eta prozesu biologiko gakoetan duten parte-hartzea karakterizatu da, hala nola erroaren xilemaren eredua. RNA/helburu bikote mugikor hautagaien zerrendak sortu dira, eta horrek bikote posibleak hautatzeko bideak ireki ditu karakterizazio biologiko gehiago egiteko. Gainera, proiektu honetan sortutako C4 mutanteekin egindako esperimentuek erakutsi dute infekzioan zehar eragindako sintomak birusek intsektu-bektorea erakartzeko erabiltzen duten estrategia bat izan daitezkeela, eta horrela landareen arteko birus-sakabanaketa handituz: faktore hau kontuan hartu behar da izurriteen kudeaketarako. - Gizarte-eragin eta inplikazio zabalagoak. RNAi landareen erregulazio-mekanismo gehienen oinarrian dagoenez, hala nola landareen hazkuntzan eta defentsa-erantzunetan parte hartzen dutenak, gai honi buruzko ikerketak bide berriak ireki ditzake labore emankorragoak eta erresilienteagoak diseinatzeko, landarearen erregulazio-mekanismo endogenoak aprobetxatuz, elementu arrotzak sartu gabe edo transgenesia erabili gabe. Gai hau funtsezkoa da etengabe hazten ari den munduko biztanleria batentzat, non laboreen ekoizpena optimizatu eta ingurumena errespetatzen duen eta modu jasangarrian egin behar den.
RSVak hainbat mailatan RNAi baino errendimendu hobea lortzeko eboluzionatu duten birus-proteinak dira, besteak beste, sRNA mugimenduan. Azken urteotan, RSV berri batek, Tomato yellow leaf curl virus-aren (TYLCV) C4 proteinak, RNAi-ren zelula arteko mugimenduan eragin berezia duela frogatu da. C4 proteina artifizialki metatzen duten landare transgenikoak, hau da, C4 adierazten duten landareak, transgenesiaren bidez sortu ziren. C4-k sRNA-en mugimenduan eraginik duenez, C4 adierazten duten landareetan duen presentziak RNA mugikorren barneko mugimenduan eragingo du.
Horrek esan nahi du RNA mugikorrak ez direla gehiago landare hauen barruan beren ohiko kokapenetara iritsiko (ezin direla behar bezala mugitu), eta degradaziorako markatzen dituzten RNAk ez direla gehiago degradatuko. Horrek esan nahi du, halaber, C4 adierazten duten landareetan RNA espezifikoen metaketa landare basatietan baino handiagoa dela ikusten bada, RNA espezie hauek RNA mugikor ustezkotzat har daitezkeela. Ikuspegi esperimental honi jarraituz, RNA espezie desberdinen metaketa-mailak aztertu ziren RNA sekuentziazio masiboaren bidez, bai C4 adierazten duten landareetan bai landare basatietan: RNA sekuentziazio-analisi hauek RNA espezifikoaren metaketari eta identitateari (sekuentziari) buruzko informazioa ematen dute. Azpimarratzekoa da RNAi dela landareek birusen moduko patogenoen aurka erabiltzen duten defentsa-mekanismo nagusia, non RNA osagarriek birusetik eratorritako RNAk degradaziorako/errepresiorako helburu dituzten.
sRNA espezie mugikor hauek isolatzeko, analisiak egin dira hainbat ikuspegi konbinatuz, hala nola txertaketa eta osagarri konbinazioak tomate transgenikoekin, TYLCV birus mutanteak erabiliz. -Emaitzen ikuspegi orokorra, ustiapena eta hedapena: C4 zunda gisa erabiliz, sRNA-en zelula arteko mugimendua kontrolatzeaz arduratzen diren proteinak, BARELY ANY MERSITEM 1/2 (BAM1/2), lehen aldiz agerian geratu ziren. BAM1/2 mintz plasmatikoan kokatutako proteinak dira, plasmodesmo izeneko egiturekin lotuta aurki daitezkeenak (zelula bat bestearekin komunikatzen duten mintzak mugatzen dituen kanalak, plasma jarraitu bat sortuz). Kokapen honetatik, BAM1/2-k RNA mugikorren zelula arteko trafikoa kontrolatzen du, eta C4-k haien mugimendua oztopatzen du BAM1/2-rekin zuzenean elkarreraginez. BAM1/2 hauen manipulazioa teknika indartsu gisa agertzen da espezie mugikor hauen mugimendua manipulatzeko.
C4 ere asko hobetu da birus-zunda gisa. Jatorrizko C4-aren eragozpen bat da, landareetan transgenikoki adierazten denean, garapen-fenotipo sendoak eragiten dituela, eta horrek RNA mugikor potentzialen isolamendua oztopatzen duela. C4 mutante desberdinak sortu ziren, oraindik RNAren mugimendua oztopatzeko gai direnak, baina garapen-fenotiporik eragin ezin dutenak. C4 mutante forma hauek sortzearekin batera, ez ziren soilik tresna bioteknologiko berriak eskuragarri jarri, baizik eta TYLCV eta tomatearen arteko elkarrekintza molekularraren alderdi gakoak ere aurkitu ziren, hots:
- Sintomen indukzioa C4-n oinarritzen da.
- Birus-sintomak TYLCVren intsektu bektorearentzat, Bemisia tabaci euli zuriarentzat, erakargarri gisa balio dutela frogatu da, eta ziurrenik birusaren sakabanaketa laguntzen dutela.
Bi alderdiek izurriteen kontrolerako estrategien diseinu eraginkorrari lagunduko diote. Ikerketa oraindik martxan dagoen arren, aurkikuntza hauek nazioarteko aldizkarietan argitaratu dira, hala nola PNAS (Fan, Aguilar et al., 2021), New Phytologist (Aguilar eta Lozano-Duran, 2022) eta Stress Biology (Aguilar eta Lozano-Duran, 2022), eta hauek Zenodo EBko biltegi publikoan aurki daitezke.
Geneen adierazpenaren erregulazioa funtsezkoa da organismo bizidunetan, barneko zein kanpoko estimuluei erantzunak ahalbidetzen baititu, hazkuntza, garapena eta erasotzaileen aurkako defentsa modulatuz. Geneen adierazpena kontrolatuz, organismo bizidunak zelulan proteina espezifikoen metaketa aldatzen du, funtzio batzuk sustatuz eta beste batzuk inhibituz, horrela oreka (homeostasia) mantenduz, asaldura potentzialetatik libre.
Gene batetik proteina-adierazpena bitartekari gisa jarduten duen RNA molekula baten mende dagoenez, tarteko RNA hori degradaziorako bideratzea modu garrantzitsua da geneen adierazpena modu oso sofistikatu eta espezifikoan lortzeko: mekanismo horri RNA isilaraztea (RNAi) deitzen zaio. RNAi-n, RNA txiki batek (sRNA) mekanismo honen elementu zentral gisa jokatzen du, beste RNA molekula osagarri bat ("bitartekari" RNA) degradaziorako bideratuz. Landareetan, RNA hauek molekula mugikor gisa karakterizatu dira, RNAi zelula batetik bestera zabaltzeko gai direnak, hasiera-guneetatik haratago, eta horrela zelula-prozesu ez-autonomo gisa jardunez.
Landareen biologian duten garrantzi handia izan arren, guztiz karakterizatutako RNA mugikor/RNA helburu bikoteen kopurua urria da, haien izaera iheskorragatik eta orain arte jarraitutako ikuspegi tradizionalen sentikortasun txikiagatik. Ikerketa proiektu honen helburu orokorra RNA mugikorren eta haien RNA helburu potentzialen isolamendua eta karakterizazio biologikoa izan zen, RNA isiltzearen birus-zapaltzaileak (VSR) zunda gisa erabiltzean oinarritutako ikuspegi guztiz berritzaile bat jarraituz.
Ekintzaren ondorioak: Tomato yellow leaf curl virus-aren (TYLCV) C4 proteina den proteina birus bat sRNA mugikorrak kopuru handitan eta bereizmen hobetuarekin isolatzeko zundarik egokiena dela identifikatu da. Horrek RNA espezie mugikor berriak eskaintzen ditu karakterizazio biologikorako, eta haien mugimendua erregulatzeaz arduratzen diren elementu genetikoak agerian utzi dira. Aurkikuntza hauek landarearen erregulazio-mekanismo endogenoak ustiatuz soilik laboreen erresilientzia eta ekoizpena handitzeko aukera irekitzen dute.
Landareetan, RNA interferentzia (RNAi) garapenetik hasi eta estres erantzunetaraino doazen prozesuetan parte hartzen du. Erregulazio-mekanismo honen elementu nagusia, RNA txikia (sRNA), hasiera-guneetatik haratago RNAi hedatzeko gai den molekula mugikor gisa karakterizatu da, zelula-prozesu ez-autonomo gisa jardunez. RNA mugikorren adibideak hauek dira: landare osoan zehar hedatzen diren birusetatik eratorriak diren eta infektatu gabeko ehunetan birusen isiltzea aktibatzeaz arduratzen diren RNA interferentzial mugikorrak (siRNA); beste RNA batzuk, mikroRNAekin (miRNA) batera, zelula-geruza desberdinetan zehar translokatzen direla deskribatu da, morfogeno gisa jardunez; azkenik, miRNA batzuk estres-baldintzetan baskulatura zeharkatzen dutela frogatu da, babes-erantzunak aktibatuz.
Beraz, RNA mugikorrak funtsezkoak dira landareen biologian, eta hainbat ikuspegi jarraitu dira horiek aztertzeko; hala ere, guztiz karakterizatutako RNA mugikor/helburu bikoteen kopurua urria da. Duela gutxi, Tomato yellow leaf curl birusaren (TYLCV) C4 proteinak RNAi-ren zelula arteko mugimenduan eragin espezifikoa duela frogatu da, RNA txikien metaketan edo jardueran eragin gabe. Proiektu honetan, C4 tresna berritzaile eta indartsu gisa erabiliko da RNA txiki mugikorrak eta haien helburuak isolatzeko, baldintza desberdinetan (infekzio basala vs. birala) eta landare desberdinetan (Arabidopsis eta tomatea), eskala handian eta bereizmen paregabearekin. C4 adierazten duten landareak erabiliz, kanpoko RNA txiki mugikorrak erraz detektatzea espero dugu, baita haien prozesatu gabeko helburuen maila handituak ere.
Birus-zunda honi esker, RNA mugikor txikien populazio desberdinen eta haien jomugen irudi osoa lortuko da, eta hautagai nabarmenenen garrantzi biologikoa ebaluatuko da. Ondorioz, landareen prozesu biologiko gakoen erregulazioari buruzko ezagutza berri garrantzitsua lortuko da, eta horrek bide berriak ireki ditzake labore emankorragoak diseinatzeko.
RNA txikiak (leiho berri batean irekiko da) (sRNA) landareetan aurkitzen diren molekulak dira, ia erregulazio-prozesu guztietan parte hartzen dutenak. Barne eta kanpoko estimuluei emandako erantzunak kontrolatzen dituzte, adibidez, eta hazkuntza modulatzen dute. Gainera, funtsezko zeregina dute RNA interferentziaren (leiho berri batean irekiko da) (RNAi) hedapenean, hau da, gene espezifikoen jarduera isilarazteko balio duen erregulazio-sistema genetiko bat. "sRNAk molekula mugikorrak dira", azaldu du GeminiDECODER proiektuaren koordinatzaile Eduardo Bejaranok, Espainiako 'La Mayora' Mediterraneoko eta Subtropikaleko Lorezaintza Institutukoak (leiho berri batean irekiko da). "Haien mugikortasunak eta aniztasunak zaildu egin dute guztiz identifikatzea eta karakterizatzea, baita haien RNA jomuga potentzialak ere".
Erronka hauek landare-prozesu garrantzitsu batzuen ulermena mugatu dute; adibidez, nola eraldatzen diren landareen erantzun lokalak sistemiko bihurtzen diren. Prozesu hau funtsezkoa da landareen defentsak aktibatzeko mantenugaien edo uraren gabeziaren edo gaixotasunen aurka. Landare-birusetatik eratorritako proteina-zundak erabili ziren GeminiDECODER proiektuan, Marie Skłodowska-Curie Actions programak babestu eta Malagako Unibertsitateak koordinatu zuena.
Espainian, proiektuak RNA mugikor horiek eta haien balizko RNA jomuga isolatzeko eta karakterizatzeko modu berriak garatzea bilatu zuen. "Horretarako, ikuspegi guztiz berria jarraitu genuen: landare-birusetatik eratorritako proteinak erabiltzea zunda gisa, RNAk bereizmen paregabearekin detektatzeko", azaldu du Bejaranok. Teknika honek, Bejaranoren ustez, zientzialariei RNA mugikorrak eta haien jomugak hobeto isolatzen lagun diezaieke landare desberdinetan, eta aplikazio potentzialak izan ditzake laboreen produktibitatea erregulatzeko. Proteinen eginkizuna garapen-prozesuetan Helburu horiek lortzeko, proiektuak landareak genetikoki transferitu zituen, C4 izeneko proteina biral bat metatu zezaten. Tomato hosto horiaren kizkurduraren birusaren (TYLCV, Geminivirus) proteina hautatu zen RNAren mugimenduan oztopatzeko duen gaitasunagatik. "C4-ren presentziak landareetan RNA mugikorren mugimenduan oztopatzen du", gaineratu du Bejaranok. "Horrek esan nahi du RNA mugikorrak ezin direla gehiago beren ohiko kokapenetara iritsi, eta degradaziorako markatutako RNAk ez direla gehiago isilaraziko".
RNA metatze maila anormalak aztertuz, Bejaranok RNA mugikorren RNA jomuga potentzialak identifikatu ahal izan zituen. Gainera, auzian zegoen RNA mugikor espezifikoaren identitateari buruzko informazioa bildu ahal izan zuen. Gene helburu horiek identifikatu ondoren, Bejaranok haien funtzio biologikoa aztertu ahal izan zuen. "Kontzeptuaren froga gisa, C4 aplikatu genuen RNA mugikorrek zehaztutako sustrai-ehunaren eredua aztertzeko", dio Bejaranok. "Horri esker, landare-proteina batzuek sRNA mugimendua sustatzeko eta landareen garapen-prozesuak kontrolatzeko duten eginkizuna agerian geratu zen". Laborantza-ekoizpen jasangarria optimizatzea GeminiDECODER-ek hainbat aurkikuntza garrantzitsu egin ditu C4 RNA zunda mugikor potentzial gisa erabiliz. RNA/jomuga bikote mugikor berriak isolatu dira eta berrespena eta karakterizazio biologikoa zain daude. "RNAi funtsezkoa da landareen mekanismo erregulatzaile gehienetan", dio Bejaranok. "Beraz, proiektu honek ikerketa-bide berriak irekitzen lagun dezake". Praktikan, RNA espezifiko baten maila altuagoak edo baxuagoak adierazten dituzten naturan dauden landareak identifikatzeak azaltzen lagun dezake zergatik izan dezaketen erresistentzia handiagoa patogenoekiko, lehortearekiko edo mantenugai-gabeziarekiko. «Arazo hau funtsezkoa da etengabe hazten ari den munduko biztanleria batentzat, laboreen ekoizpena optimizatu eta modu ekologikoki egokian eta jasangarrian egin behar baita», dio Bejaranok.
- UNIVERSIDAD DE MALAGA
- SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES
- CORDIS proiektuaren fitxa (pdf)
- Web ikertzailea
- BAM1 eta BAM2 hartzaileen antzeko kinasak beharrezkoak dira erroaren xilemaren …
- Tombusvirus P19 proteinak RNA isilarazteko mugimendua inhibitzeari buruz: sRNA …
- Landare-birusak laboreetan estres abiotikoarekiko tolerantzia diseinatzeko zund…
- Malagako Unibertsitatearen webgunea
Lotutako proiektuak
