Projet H2020 GeminiDECODER : Isolement et caractérisation de paires mobiles ARNs/cible chez les plantes en utilisant une protéine virale comme sonde
- Taper Projet
- Statut Rempli
- Exécution 2020 -2023
- Budget alloué 237.065,28 €
- Portée Europeo
- Communauté autonome Andalucía
- Principale source de financement Horizon 2020
- Site Web du projet https://doi.org/10.3030/896910
Les petits ARN régulateurs (ARNs) sont omniprésents chez les plantes. Ils jouent un rôle essentiel dans la propagation de l'interférence ARN (ARNi), un système de régulation génétique qui inhibe l'activité de gènes spécifiques. Compte tenu de la diversité des ARN et de leurs cibles, ainsi que de leur mobilité, il a été difficile d'identifier et de caractériser pleinement les paires d'ARN mobiles et leurs cibles. Le projet GeminiDECODER, financé par l'UE, utilise une nouvelle sonde avec une résolution sans précédent : une protéine issue d'un virus végétal dont l'effet sur la propagation intercellulaire de l'ARNi a été récemment démontré. Elle promet d'aider les scientifiques à isoler les ARN mobiles et leurs cibles dans différentes conditions chez différentes plantes, avec des applications potentielles pour réguler la productivité des cultures. Ce projet a permis l'isolement et la caractérisation des ARNs mobiles et de leurs cibles potentielles, à grande échelle et avec une résolution sans précédent, grâce à une approche totalement nouvelle qui a surmonté les limites traditionnelles telles que le manque de spécificité, la létalité liée à l'utilisation de plantes mutantes et la contamination des échantillons.
Ce travail présente une analyse comparative de l'efficacité de certains de ces VSR lorsqu'ils sont utilisés comme sondes virales, et les données indiquent que le TYLCV C4 est la sonde virale la plus efficace. En utilisant le C4, des protéines impliquées dans la régulation du mouvement intercellulaire des ARN ont été démontrées et leur implication dans des processus biologiques clés, tels que la structuration du xylème racinaire, a été caractérisée. Des listes de paires ARN mobile/cible candidates ont été générées, ouvrant la voie à la sélection de paires putatives pour une caractérisation biologique plus poussée. De plus, des expériences avec les mutants C4 générés dans ce projet ont montré que les symptômes induits lors de l'infection pourraient représenter une stratégie déployée par les virus pour attirer l'insecte vecteur, augmentant ainsi la dispersion virale parmi les plantes : ce facteur devrait être pris en compte dans la gestion des ravageurs. - Impact sociétal plus large et implications. L'ARNi étant à la base de la plupart des mécanismes de régulation des plantes, notamment ceux impliqués dans la croissance et les mécanismes de défense, la recherche sur ce sujet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives pour la conception de cultures plus productives et plus résilientes, simplement en exploitant les mécanismes de régulation endogènes de la plante, sans introduction d'éléments étrangers ni recours à la transgénèse. Ce sujet est primordial pour une population mondiale en constante augmentation, où la production agricole doit être optimisée et menée de manière écologique et durable.
Les VRS sont des protéines virales qui ont naturellement évolué pour surpasser l'ARN interférent à plusieurs niveaux, notamment au niveau du mouvement des petits ARN. Ces dernières années, il a été démontré qu'un nouveau VRS, la protéine C4 du virus de la cloque jaune de la tomate (TYLCV), interfère spécifiquement avec le mouvement intercellulaire de l'ARN interférent. Des plantes transgéniques accumulant artificiellement la protéine C4, c'est-à-dire des plantes exprimant C4, ont été générées par transgénèse. Comme C4 interfère avec le mouvement des petits ARN, sa présence chez les plantes exprimant C4 interfère avec le mouvement des ARN mobiles endogènes.
Cela signifie que les ARN mobiles n'atteindront plus leurs emplacements habituels dans ces plantes (ils ne peuvent pas se déplacer correctement), et les ARN qu'ils marquent pour la dégradation ne seront plus dégradés. Cela signifie également que si l'accumulation d'ARN spécifiques dans les plantes exprimant C4 s'avère plus élevée que dans les plantes sauvages, ces espèces d'ARN peuvent être considérées comme des ARN mobiles putatifs. Suite à cette approche expérimentale, les niveaux d'accumulation de différentes espèces d'ARN ont été analysés par séquençage massif d'ARN chez les plantes exprimant C4 et les plantes sauvages : ces analyses de séquençage d'ARN fournissent des informations sur l'accumulation et l'identité (séquence) de l'ARN spécifique. Notamment, l'ARNi constitue le principal mécanisme de défense que les plantes déploient contre les agents pathogènes tels que les virus, où les ARN complémentaires ciblent les ARN dérivés des virus pour la dégradation/répression.
Afin d'isoler ces espèces d'ARNs mobiles, des analyses ont été réalisées en combinant différentes approches, telles que le greffage et la complémentation avec des tomates transgéniques, impliquant l'utilisation de virus TYLCV mutants. -Aperçu des résultats, exploitation et dissémination : En utilisant C4 comme sonde, les protéines responsables du contrôle du mouvement intercellulaire des ARNs, BARELY ANY MERSITEM 1/2 (BAM1/2), ont été exposées pour la première fois. Les BAM1/2 sont des protéines situées dans la membrane plasmique, que l'on peut trouver associées à des structures appelées plasmodesmes (canaux délimités par la membrane plasmique qui communiquent d'une cellule à l'autre, créant un continuum plasmatique). À partir de cet emplacement, BAM1/2 contrôle le trafic intercellulaire des ARN mobiles, et C4 interfère avec leur mouvement en interagissant directement avec BAM1/2. La manipulation de ces BAM1/2 apparaît alors comme une technique puissante pour manipuler le mouvement de ces espèces mobiles.
Le C4 a également été grandement amélioré comme sonde virale. L'un des inconvénients du C4 original est que, lorsqu'il est exprimé de manière transgénique chez les plantes, il induit de forts phénotypes développementaux, ce qui interfère avec l'isolement d'ARN potentiellement mobiles. Différents mutants du C4 ont été générés, toujours capables d'interférer avec le mouvement de l'ARN, mais incapables d'induire des phénotypes développementaux. La génération de ces mutants du C4 a non seulement permis de mettre à disposition de nouveaux outils biotechnologiques, mais également de découvrir des aspects clés de l'interaction moléculaire entre le TYLCV et la tomate, à savoir :
- L'induction des symptômes est basée sur C4.
- Il a été démontré que les symptômes viraux servent d’attractifs pour l’insecte vecteur du TYLCV, l’aleurode Bemisia tabaci, contribuant probablement à la dispersion du virus.
Ces deux aspects contribueront à la conception efficace de stratégies de lutte antiparasitaire. Bien que les recherches soient toujours en cours, ces résultats ont été publiés dans des revues internationales telles que PNAS (Fan, Aguilar et al., 2021), New Phytologist (Aguilar et Lozano-Duran, 2022) et Stress Biology (Aguilar et Lozano-Duran, 2022), disponibles dans la base de données publique européenne Zenodo.
La régulation de l'expression des gènes est essentielle chez les organismes vivants. Elle permet de répondre aux stimuli internes et externes, de moduler la croissance, le développement et la défense contre les agents pathogènes. En contrôlant l'expression des gènes, l'organisme vivant modifie l'accumulation de protéines spécifiques dans la cellule, favorisant certaines fonctions et en inhibant d'autres, préservant ainsi l'équilibre (homéostasie) de toute perturbation potentielle.
L'expression protéique d'un gène dépendant d'une molécule d'ARN servant d'intermédiaire, cibler cet ARN intermédiaire pour sa dégradation est un moyen important d'obtenir une expression génique hautement sophistiquée et spécifique : ce mécanisme est appelé silençage de l'ARN (ARNi). Dans l'ARNi, un petit ARN (ARNs) joue le rôle central de ce mécanisme, ciblant une autre molécule d'ARN complémentaire (l'ARN « intermédiaire ») pour sa dégradation. Chez les plantes, ces ARN ont été caractérisés comme des molécules mobiles capables de propager l'ARNi de cellule en cellule, au-delà des sites d'initiation, agissant ainsi comme un processus cellulaire non autonome.
Malgré leur importance cruciale pour la biologie végétale, le nombre de paires ARN mobile/ARN cible entièrement caractérisées est limité, en raison de leur nature insaisissable et de la faible sensibilité des approches traditionnelles suivies jusqu'à présent. L'objectif général de ce projet de recherche était l'isolement et la caractérisation biologique des ARN mobiles et de leurs ARN cibles potentiels, selon une approche totalement novatrice basée sur l'utilisation de suppresseurs viraux du silençage de l'ARN (VSR) comme sondes.
Conclusions de l'étude : Une protéine virale, la protéine C4 du virus de la cloque jaune de la tomate (TYLCV), a été caractérisée comme la sonde la plus adaptée à l'isolement des ARNs mobiles en masse et avec une résolution améliorée. Cela fournit de nouvelles espèces d'ARNs mobiles pour la caractérisation biologique, et les éléments génétiques responsables de la régulation de leur mouvement ont été exposés. Ces résultats ouvrent la voie à une amélioration de la résilience et de la production des cultures, uniquement par l'exploitation des mécanismes de régulation endogènes de la plante.
Chez les plantes, l'interférence ARN (ARNi) est impliquée dans des processus allant du développement aux réponses au stress. L'élément central de ce mécanisme de régulation, le petit ARN (ARNs), a été caractérisé comme une molécule mobile capable de propager l'ARNi au-delà des sites d'initiation, agissant comme un processus cellulaire non autonome. Parmi les ARN mobiles, on peut citer : les ARN interférents mobiles (ARNsi), dérivés de virus qui se propagent dans toute la plante et sont responsables de l'activation du silençage viral dans les tissus non infectés ; d'autres ARN, ainsi que les microARN (miARN), ont été décrits comme se déplaçant à travers différentes couches cellulaires, agissant comme des morphogènes ; enfin, certains miARN se sont avérés se déplacer à travers le système vasculaire en conditions de stress, activant des réponses protectrices.
Les ARN mobiles sont donc d'une importance vitale pour la biologie végétale, et diverses approches ont été suivies pour les analyser ; cependant, le nombre de paires ARN mobiles/cibles entièrement caractérisées est rare. Récemment, il a été démontré que la protéine C4 du virus de la cloque jaune de la tomate (TYLCV) interfère spécifiquement avec le mouvement intercellulaire de l'ARNi, sans affecter l'accumulation ou l'activité des petits ARN. Dans ce projet, la protéine C4 sera utilisée comme un outil novateur et puissant pour isoler les petits ARN mobiles et leurs cibles, dans différentes conditions (infection basale ou virale) et chez différentes plantes (Arabidopsis et tomate), à grande échelle et avec une résolution sans précédent. En utilisant des plantes exprimant la protéine C4, nous espérons détecter facilement les petits ARN mobiles hors site, ainsi que des niveaux accrus de leurs cibles non traitées.
Grâce à cette sonde virale, une image complète des différentes populations de petits ARN mobiles et de leurs cibles sera obtenue, et la pertinence biologique des candidats les plus importants sera évaluée. De nouvelles connaissances pertinentes sur la régulation des processus biologiques clés chez les plantes seront ainsi acquises, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour la conception de cultures plus productives.
Les petits ARN (s'ouvre dans une nouvelle fenêtre) (sARN) sont des molécules présentes dans les plantes et impliquées dans pratiquement tous les processus de régulation. Ils contrôlent par exemple les réponses aux stimuli internes et externes et modulent la croissance. Ils jouent également un rôle essentiel dans la propagation de l'interférence ARN (s'ouvre dans une nouvelle fenêtre) (ARNi), un système de régulation génétique qui inhibe l'activité de gènes spécifiques. « Les ARNs sont des molécules mobiles », explique Eduardo Bejarano, coordinateur du projet GeminiDECODER à l'Institut d'horticulture méditerranéenne et subtropicale « La Mayora » (s'ouvre dans une nouvelle fenêtre) en Espagne. « Leur mobilité et leur diversité rendent difficile leur identification et leur caractérisation complètes, ainsi que leurs cibles ARN potentielles. »
Ces défis ont limité notre compréhension de plusieurs processus végétaux importants ; par exemple, la façon dont les réponses locales se transforment en réponses systémiques. Ce processus est essentiel à l'activation des défenses des plantes contre la carence en nutriments ou en eau, ou contre les maladies. Des sondes protéiques dérivées de virus végétaux ont été utilisées dans le cadre du projet GeminiDECODER, soutenu par le programme Actions Marie Skłodowska-Curie et coordonné par l'Université de Malaga.
En Espagne, le projet visait à développer de nouvelles méthodes pour isoler et caractériser ces ARN mobiles et leurs cibles potentielles. « Pour ce faire, nous avons adopté une approche totalement novatrice : utiliser des protéines dérivées de virus végétaux comme sondes pour détecter les ARN avec une résolution sans précédent », explique Bejarano. Selon Bejarano, cette technique pourrait aider les scientifiques à mieux isoler les ARN mobiles et leurs cibles dans différentes plantes, et pourrait avoir des applications potentielles dans la régulation de la productivité des cultures. Le rôle des protéines dans les processus de développement. Pour atteindre ces objectifs, le projet a transféré génétiquement des plantes afin qu'elles accumulent une protéine virale appelée C4. La protéine du virus de la cloque jaune de la tomate (TYLCV, Geminivirus) a été sélectionnée pour sa capacité à interférer avec le mouvement des ARN. « La présence de C4 dans les plantes interfère avec le mouvement des ARN mobiles », ajoute Bejarano. « Cela signifie que les ARN mobiles ne peuvent plus atteindre leurs emplacements habituels et que les ARN destinés à la dégradation ne seront plus inhibés. »
En analysant les niveaux anormaux d'accumulation d'ARN, Bejarano a pu identifier des cibles potentielles pour les ARN mobiles. Il a également pu recueillir des informations sur l'identité de l'ARN mobile en question. Une fois ces gènes cibles identifiés, Bejarano a pu analyser leur fonction biologique. « Pour démontrer le concept, nous avons appliqué C4 à l'analyse de la structure des tissus racinaires déterminée par les ARN mobiles », explique Bejarano. « Cela nous a permis de mettre en évidence le rôle de certaines protéines végétales dans la promotion du mouvement des ARNs et le contrôle des processus de développement des plantes. » Optimiser la production agricole durable. GeminiDECODER a réalisé plusieurs découvertes importantes en utilisant C4 comme sonde potentielle pour l'ARN mobile. De nouvelles paires ARN mobile/cible potentielles ont été isolées et attendent confirmation et caractérisation biologique. « L'ARNi est fondamental pour la plupart des mécanismes de régulation chez les plantes », souligne Bejarano. « Ce projet pourrait donc ouvrir de nouvelles perspectives de recherche. » D'un point de vue pratique, l'identification des plantes naturelles exprimant des niveaux plus ou moins élevés d'un ARN spécifique pourrait contribuer à expliquer leur plus grande résistance aux agents pathogènes, à la sécheresse ou à la carence en nutriments. « Cet enjeu est crucial dans un contexte de croissance démographique mondiale constante, où la production agricole doit être optimisée et menée de manière écologiquement rationnelle et durable », explique Bejarano.
- UNIVERSIDAD DE MALAGA
- SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES
- Fiche d'information du projet CORDIS (pdf)
- Chercheur Web
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- Site Web de l'Université de Malaga
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