H2020 BIOFERTICELLULASER Proiektua: Bakterioen zelulasen eginkizuna bizidun asketik sustraietako endofitoetarako trantsizioan koltza laboreetan eta bioongarri eraginkorren diseinuan
- Mota Proiektua
- Egoera Bete
- Exekuzioa 2017 -2019
- Esleitutako Aurrekontua 170.121,6 €
- Eremua Europeo
- Finantza-iturri nagusia H2020
- Proiektuaren webgunea BIOFERTICELLULASER
B. napus endofitoen isolamendua PGP jarduerarekin eta landareen zelulen konposatuetan entzima hidrolitikoak ekoizteko gaitasunarekin: koltza bakterio endofitoen bilduma lortu zen medio aberatsak eta minimoak konbinatuz, bakterio endofitoen biodibertsitate zabala isolatzeko. PGP ezaugarriak eta entzima hidrolitikoen ekoizpena in vitro ebaluatu ziren bakterio isolatu guztietan, eta andui guztiak espezie mailan identifikatu ziren. In vitro hobekien hautatutako bakterio isolatuek landareen hazkuntza sustatzeko duten gaitasuna ere ebaluatu da.
Infekzioan gehiegi adierazitako geneen identifikazioa: Pseudomonas brassicacearum CDVBN10 bakterioa landareen hazkuntzaren sustatzaile onenetako bat bezala identifikatu zen. Hori dela eta, sustraiaren gainazaleko gene-adierazpenaren analisi transkriptomikorako hautatu zen. Bakterio-gene multzo bat aukeratu zen infekzioan zehar gehiegi adierazita egon zedin. Bat ere ez zegokion bakterio zelulasa bati. Hori dela eta, proiektuaren hasierako hipotesia egokitu zen beste bakterio-entzima batzuek landarearekiko elkarrekintzan duten eginkizuna ebaluatzeko. Poliaminen biosintesian parte hartzen duen N-karbamoil putreszina amidasa kodetzen duen gehiegizko gene batean zentratu ginen.
Andui mutanteen isolamendua: CRISPR/Cas genomaren edizioa erabili dugu P. brassicacearum CDVBN10-n N-carbamoyl putrescine amidasa kodetzen duen genea desaktibatzeko.
Eratorritako andui mutanteen fenotipo sinbiotikoen azterketa: N-carbamoyl putrescine amidasa KO mutantearen fenotipo sinbiotikoa aztertu dugu sustraiaren kolonizazioan, sustraien finkapenean, sustrai-ileen deformazioan eta sustraiaren infekzioan. Sustraietako ilearen deformazioetan fenotipo mutante desberdin bat detektatu berri dugu: WT-ak sustraiaren ilearen deformazioa eragiten du B. napus-en, eta tentsio mutanteak, berriz, inokulatu gabeko kontrolarekin pareko sustrai-ileen deformazio mailak erakusten ditu. Fenotipoa putreszina gehituz berreskuratzen da.
N-carbamoyl putrescine amidasak PGP eraginkortasunean duen eginkizunaren analisia: WT eta andui mutanteek landareen hazkuntza sustatzeko eta landareen estresaren erresistentzia eragiteko estres-baldintza biotiko (fitopatogenoa Phoma lingam) eta abiotiko (gatza) (gazitasuna) baldintza alderatu dugu, mutantearen narriadura nabarmena ikusiz gaitasun horietan. Fenotipoak putreszina gehituta berreskuratzen dira.
PGP P. brassicacearum CDVBN10 bakterio endofitoaren eraginkortasunaren analisia koltza-hazien infekzioan eta laborearen etekinak areagotzean: P. brassicacearum CDVBN10 landa-baldintzetan probatu zen koltzarentzako bioongarri gisa. Pseudomonas generoa inokulatutako landareetan taxon nagusietako bat izan zen, bakterioek eremuan erro endofito gisa finkatzeko duten eraginkortasuna adierazten zuen. Gainera, landareen tamaina eta hazien ekoizpena nabarmen handitzen joan ziren inokulatutako landareetan, labore hauentzako bakterio-ongarri gisa duen eraginkortasuna frogatuz.
FAOren arabera, 2050. urterako 2.300 milioi pertsona gehiago egongo dira planetan, eta elikagai gehiago ekoiztu beharko dituzte, aldi berean, dauden pobreziari eta goseari aurre eginez, baliabide natural urriak modu eraginkorragoan erabiliz eta klima-aldaketara egokituz.
Ongarri kimikoek laboreen errendimendua areagotzen dute, baina eragin negatiboak dituzte gizakien eta animalien osasunean, baita ingurumenean ere. Landareen produktibitatea hobetu daiteke landareen hazkundea sustatzen duten bakterioen (PGB) jardueraren bidez, bere jarduera metabolikoen bidez landareen hazkundea modulatzeko gai diren bakterio naturalak. Hala ere, lekale-laboreetan aplikatutako andui errizobikoak izan ezik, in vitro ikerketetatik diseinatutako bioongarri gehienek huts egiten dute lantokian aplikatzen direnean. Porrot hori lurzoruari aplikatu ondoren, in vitro aukeratutako PGP bakterioak lurzoruan dauden mikroorganismo askotarikoekin lehiatu eta ingurune bakoitzeko baldintza abiotiko ezberdinetara egokitu behar direlako izan daiteke (tenperatura tartea, ur/lehortasun aldiak, etab.). Gertaera honek bakterio endofitoen PGP potentzialarekiko interesa areagotzen du (endorrizan (sustraiaren barnealdean) sartzeko gaitasuna duten bakterioak), izan ere, landarean sartu ondoren, ez baitute errizosferan dagoen bakterioen populazio trinkoarekin lehiatu behar eta muturreko baldintza abiotikoetatik babestuta daude. Hala ere, kolonizazio endofitikoa, errizobioen eta lekaleen arteko elkarrekintza ondo aztertuta ez ezik, ez da ondo ulertzen. Endofitoak sustraietan aktiboki sartzen diren mekanismoak argi gehiago emateak, ziurrenik, aurrerapen handiak ahalbidetuko ditu lekadunak ez diren laboreetan bioongarri eraginkor gisa jardun dezaketen bakterio-tentsioen aukeraketa adimentsuan.
Brassica napus L. (koltza) laborantza garrantzitsua da elikadura-baliabide gisa ez ezik (giza eta animalia), biodiesela ekoizteko ere lantzen duelako. Europan, B. napus haziak dira biodiesela ekoizteko olio iturri nagusia. Hala ere, koltza haziak ongarri kimiko kopuru handiak behar ditu, eta, beraz, laborantza iraunkorragorako ongarri kimikoa murrizten duten alternatibak oso desiragarriak dira. Honek bioongarrien erabilera dakar, horien artean PGP bakterio endofitikoak.
Beraz, proiektu honen helburuak hauek izan dira:
- B. napusen PGP endofitoen isolamendua
- Infekzio-prozesuan zehar gehiegi adierazitako geneen identifikazioa.
- Zelulasa kodetzen duten geneetako andui mutanteen isolamendua.
- Eratorritako andui mutanteen fenotipo sinbiotikoen azterketa.
- Bakterioen zelulasen paperaren analisia PGP eraginkortasunean.
- Hautatutako bakterioen eraginkortasunaren analisia koltza infektatzeko eta laborearen errendimendua handitzeko.
Datozen hamarkadetan gizateriaren erronka nagusietako bat elikagaien ekoizpena areagotzea izango da, baliabide urriak ustiatuz eta ingurumena babestuz, Europako Horizon 2020 Programaren lehentasunetako bat bihurtuz. Landareen produktibitatea hobetu daiteke landareen hazkuntza sustatzen duten bakterioen (PGB) jardueraren bidez, nekazaritzako soroetan bioongarri edo probiotiko gisa aplikatuta, laboreen errendimenduak handitzeko ingurumena errespetatzen duen modua izanik. Bioongarriak nekazaritzan hainbat hamarkadatan erabili izan dira, baina kasu askotan, laborategiko baldintzetan PGP gisa potentzial handia erakutsi duten bakterioek huts egiten dute lurzoru naturalei aplikatzen zaizkienean, ziurrenik lurzoruko mikrobio-populazio autoktonoek gainditzen dituztelako edo ingurune-baldintza berrietara egokitu ezin direlako.
Rhizobium-clover ereduan oinarrituta, bakterio zelulasak funtsezkoak direla ezagutzen da bakterioak sustraian sartzeko. Hala ere, oraindik ez da aztertu entzima hauek bakterio endofitoak labore ez-lekadunen sarrera aktiboan duten inplikazioa. Proiektu honek, ikuspegi transkriptomiko bat erabiliz eta andui mutanteen isolamendua erabiliz, endofitoek landare ez-lekadunen sustraietan sartzeko zelulasek duten papera ikertu nahi du, koltza (B. napus) landare eredu gisa erabiliz. Zelulasak kodetzen dituzten geneek sustrai-infekzio aktiboa ahalbidetzen badute, mekanismo pasiboen aldean abantaila batekin, bakterio-tentsioak PGP ahalmenaren arabera ez ezik, landarean barneratzeko duten gaitasunaren arabera ere hautatzeak —lehiakide gutxiago dituzten eta estres abiotikotik babestuta dauden— bakterio-ongarri eraginkorragoak diseinatzea ahalbidetuko du. Proiektu honen azken helburua da ongarri kimikoen (giza osasunerako eta ingurumenerako arriskutsuak diren eta klima-aldaketan laguntzen duten) ongarri kimikoen erabilera murriztu edo are ezabatuko duten mikrobioetan oinarritutako ongarri biologikoak garatzeko oinarriak finkatzea, laboreen ekoizpena mantenduz edo areagotuz.
Proiektu honetan, Pseudomonas brassicacearum CDVBN10 koltza bakterio endofitoa laborategiko eta landa-baldintzetan koltza-ongarri bakteriano eraginkorra dela frogatzen dugu eta, horrez gain, landareen erresistentzia eragiten duela estres biotiko eta abiotiko-baldintzetarako.
Gainera, sustraiaren gainazaleko bakterioen transkriptomian oinarrituta, aurkitu dugu N-carbamoyl putrescine amidasa bat kodetzen duen genea, poliaminen biosintesian parte hartzen duen entzima bat, nabarmen gainespresatuta zegoela, landarearekiko interakzioan eginkizun garrantzitsua izan daitekeela adieraziz. Knockout mutante eratorritako andui baten eraikuntzak erakutsi zuen nola geneak paper garrantzitsua jokatzen duen bakterioen B. napus-en hazkuntza sustatzeko eta estres abiotiko-baldintzekiko (gatz-gazia) eta onddo fitopatogenoen (Phoma lingam) erasoarekiko duen erresistentzia eragiteko. Dakigunez, landareen hazkuntza sustatzen duen bakterio batean poliaminen sintesian parte hartzen duen gene batek ezabatzeak landareen hazkuntza sustatzeko eta estresaren erresistentzia eragiteko duen gaitasunari buruzko lehen txostena da.
Hori dela eta, proiektua lekadun ez diren landareen eta PGP bakterioen arteko elkarreraginei buruz dagoen ezagutzan oinarritzen da, beharrezkoa dena bakterio-ongarrien diseinu eraginkorragorako. Gainera, proiektuak frogatzen du Pseudomonas brassicacearum CDVBN10 anduiak koltza-laboreetarako bioongarri gisa duen potentzial handia, laborantza honetan ongarri kimikoen erabilera murriztuko lukeena, ingurumenean eta kontsumitzaileen osasunean eragin positibo handia eraginez.
- UNIVERSIDAD DE SALAMANCA (USAL)
Lotutako proiektuak
