H2020 BIOFERTICELLULASER Proiektua: Bakterio-zelulasen eginkizuna koltza-laboreetan bizitza libretik sustrai-endofitoetara igarotzean eta bioongarri eraginkorren diseinuan
- Mota Proiektua
- Egoera Bete
- Exekuzioa 2017 -2019
- Esleitutako Aurrekontua 170.121,6 €
- Eremua Europeo
- Finantza-iturri nagusia Horizonte 2020
- Proiektuaren webgunea BIOFERTICELLULASER
PGP jarduera duten B. napus endofitoen isolamendua eta landare-zelulen konposatuetan entzima hidrolitikoak sortzeko gaitasuna: Kolza bakterioen endofitoen bilduma bat lortu zen ingurune aberatsak eta minimoak konbinatuz, bakterioen endofitoen biodibertsitate zabala isolatzeko. PGPren ezaugarriak eta entzima hidrolitikoaren ekoizpena in vitro ebaluatu ziren bakterio isolatu guztietan, eta andui guztiak espezie mailan identifikatu ziren. Landareen hazkuntza sustatzeko in vitro bakterio isolatu onenen gaitasuna ere ebaluatu zen in plantan.
Infekzioan gehiegi adierazten diren geneen identifikazioa: Pseudomonas brassicacearum CDVBN10 bakterioa landareen hazkuntzaren sustatzaile onenetako bat bezala identifikatu zen. Beraz, sustraiaren gainazaleko geneen adierazpenaren transkriptomikako analisietarako hautatu zen. Bakterio-gene multzo bat hautatu zen infekzioan zehar gehiegi adierazita egon zitezkeelako. Bat ere ez zen bakterio-zelulasa bati dagokiona. Beraz, proiektuaren hasierako hipotesia egokitu zen landarearekin elkarreraginean beste bakterio-entzima batzuek duten zeregina ebaluatzeko. Poliaminen biosintesian parte hartzen duen N-karbamoil putreszina amidasa bat kodetzen duen gehiegi adierazitako gene batean zentratu ginen.
Mutanteen anduien isolamendua: CRISPR/Cas genomaren edizioa erabili genuen P. brassicacearum CDVBN10-n N-karbamoil putreszina amidasa kodetzen duen genea inaktibatzeko.
Mutante eratorritako anduien fenotipo sinbiotikoen azterketa: N-karbamoil putreszina amidasa KO mutantearen fenotipo sinbiotikoa aztertu genuen sustraien kolonizazioan, sustraien finkapenean, sustraien ilearen deformazioetan eta sustraien infekzioan. Sustrai-ilearen deformazioetan fenotipo mutante bereizgarri bat detektatu berri dugu: WT-k sustrai-ilearen deformazioa eragiten du B. napus-en, eta andui mutanteak, berriz, txertatu gabeko kontrol-taldearen pareko sustrai-ilearen deformazio-mailak erakusten ditu. Fenotipoa berreskuratzen da putreszina gehituz.
N-karbamoil putreszina amidasaren PGP eraginkortasunean duen eginkizunaren azterketa: WT eta mutante anduien gaitasuna alderatu genuen landareen hazkundea sustatzeko eta landareen estres biotikoarekiko (Phoma lingam fitopatogenoa) eta abiotikoarekiko (gazitasunarekiko) erresistentzia eragiteko, mutantearen gaitasun horietan narriadura nabarmena ikusiz. Fenotipoak berreskuratzen dira putreszina gehituz.
PGP P. brassicacearum CDVBN10 bakterio endofitoaren eraginkortasunaren azterketa koltzaren infekzioan eta laboreen etekinak handitzean: P. brassicacearum CDVBN10 landako baldintzetan probatu zen koltzarako bioongarri gisa. Pseudomonas generoa izan zen inokulatutako landareetan taxon nagusietako bat, eta horrek adierazten du bakterioaren eraginkortasuna sustrai-endofito gisa finkatzeko soroan. Gainera, landareen tamaina eta hazien ekoizpena nabarmen handitu zirela zirudien txertatutako landareetan, labore horientzako bioongarri bakteriano gisa duen eraginkortasuna frogatuz.
FAOren arabera, 2050erako 2.300 milioi pertsona gehiago egongo dira planetan, eta horiek janari gehiago ekoiztu beharko dute, aldi berean pobrezia eta gosea borrokatuz, baliabide natural urriak modu eraginkorragoan erabiliz eta klima-aldaketara egokituz.
Ongarri kimikoek uzta handitzen dute, baina eragin negatiboak dituzte gizakien eta animalien osasunean, baita ingurumenean ere. Landareen produktibitatea hobetu daiteke landareen hazkuntza sustatzen duten bakterioen (PGB) jardueraren bidez, hau da, landareen hazkuntza beren jarduera metabolikoen bidez modulatzeko gai diren bakterio naturalen bidez. Hala ere, lekale-laboreetan aplikatzen diren errizobiko anduiak izan ezik, in vitro ikerketetatik diseinatutako bioongarri gehienek huts egiten dute soroan aplikatzean. Porrot hau gerta liteke lurzoruan aplikatu ondoren, in vitro hautatutako PGP bakterioek lurzoruan dauden mikroorganismo askotarikoekin lehiatu eta ingurune bakoitzaren baldintza abiotiko desberdinetara egokitu behar dutelako (tenperatura-tartea, ur/lehorte aldiak, etab.). Gertakari honek areagotu egiten du bakterio endofitoen (endorizara (sustraiaren barnealdea) sartzeko gaitasuna duten bakterioen) PGP potentzialarekiko interesa, landarearen barruan sartuta ez baitute errizosferako bakterioen populazio trinkoarekin lehiatu beharrik eta muturreko baldintza abiotikoetatik babestuta baitaude. Hala ere, kolonizazio endofitikoa, errizobioen eta lekaleen arteko elkarrekintza ondo aztertuez gain, ez da ondo ulertzen. Endofitoak sustraietan aktiboki sartzeko mekanismoei buruzko argitasun handiagoa emateak aurrerapen handiak ahalbidetuko ditu lekaleak ez diren laboreetan bioongarri eraginkor gisa joka dezaketen bakterio-anduien hautaketa adimentsuan.
Brassica napus L. (koltza) labore garrantzitsua da, ez bakarrik elikagai-baliabide gisa (gizakientzat eta animalientzat), baita biodiesela ekoizteko ere lantzen delako. Europan, B. napus haziak dira biodiesela ekoizteko olio-iturri nagusia. Hala ere, koltza laborantzak ongarri kimiko kantitate handiak behar ditu, eta, beraz, oso desiragarriak dira laborantza jasangarriagoa lortzeko ongarri kimikoa murrizten duten alternatibak. Horrek bioongarriak erabiltzea dakar, eta horien artean PGP bakterio endofitoak daude.
Beraz, proiektu honen helburuak hauek izan ziren:
- PGP endofitoen isolamendua B. napus-etik
- Infekzio prozesuan gehiegi adierazten diren geneen identifikazioa.
- Zelulasa kodetzen duten geneetan andui mutanteen isolamendua.
- Eratorritako andui mutanteen fenotipo sinbiotikoen azterketa.
- Bakterio-zelulasen zereginaren azterketa PGPren eraginkortasunean.
- Koltza infektatzeko eta uzta handitzeko hautatutako bakterioen eraginkortasunaren azterketa.
Gizateriaren erronka nagusietako bat datozen hamarkadetan baliabide urriak ustiatuz eta ingurumena babestuz elikagaien ekoizpena handitzea izango da, eta hori Europako Horizon 2020 Programaren lehentasunetako bat bihurtuko da. Landareen produktibitatea hobetu daiteke landareen hazkuntza sustatzeko bakterioen (PGB) jardueraren bidez, nekazaritza-soroetan bioongarri edo probiotiko gisa aplikatuz, uzta handitzeko modu ekologikoa osatuz. Bioongarriak hamarkadetan erabili izan dira nekazaritzan, baina kasu askotan, laborategiko baldintzetan PGP gisa potentzial handia erakutsi duten bakterioek huts egiten dute lurzoru naturaletan aplikatzean, ziurrenik lurzoruko mikrobio-populazio natiboek gainditzen dituztelako edo ingurumen-baldintza berrietara egokitu ezin direlako.
Rhizobium-hirusta ereduan oinarrituta, bakterio-zelulasak funtsezkoak direla ezagutzen da bakterioak sustraira sartzeko. Hala ere, entzima hauen parte-hartzea bakterio endofitoen lekaleak ez diren laboreetan sartzean ez da oraindik aztertu. Proiektu honek, transkriptomikoki aztertuz eta endofito mutanteen anduien isolamendua erabiliz, zelulasek endofitoek lekaleak ez diren landareen sustraietan sartzeko duten gaitasunean duten zeregina ikertzea du helburu, koltza (B. napus) landare eredu gisa erabiliz. Zelulasak kodetzen dituzten geneek sustraien infekzio aktiboa ahalbidetzen badute, mekanismo pasiboekiko abantaila batekin, bakterioen anduiak hautatzeak ez bakarrik PGP gaitasunaren arabera, baita landarean sartzeko duten gaitasunaren arabera ere —non lehiakide gutxiago dituzten eta estres abiotikotik babestuta dauden— bakterioen bioongarri eraginkorragoak diseinatzea ahalbidetuko du. Proiektu honen azken helburua da ongarri biologiko mikrobianoak garatzeko oinarriak ezartzea, ongarri kimikoen erabilera (gizakien osasunerako eta ingurumenerako arriskutsuak direnak, eta klima-aldaketan laguntzen dutenak) murriztu edo baita ezabatu ere egingo dutenak, laboreen ekoizpena mantenduz edo handituz.
Proiektu honetan, frogatzen dugu Pseudomonas brassicacearum CDVBN10 koltza-endofito bakterianoa koltzarako ongarri bakteriano eraginkorra dela laborategiko eta landa-baldintzetan eta, gainera, landareek estres biotiko eta abiotikoarekiko erresistentzia eragiten dutela.
Gainera, sustraien gainazaleko bakterioen transkriptomikan oinarrituta, ikusi genuen poliaminen biosintesian parte hartzen duen N-karbamoil putreszina amidasa kodetzen duen genea nabarmen gehiegi adierazita zegoela, eta horrek landarearekin elkarreraginean zeregin garrantzitsua izan dezakeela adierazten du. Mutante knockout batetik eratorritako andui baten eraikuntzak erakutsi zuen geneak zeresan handia duela bakterioen B. napus-en hazkuntza sustatzeko eta estres abiotikoarekiko (gatz) eta onddo fitopatogenoen (Phoma lingam) erasoarekiko erresistentzia eragiteko gaitasunean. Gure ezagutzaren arabera, hau da landareen hazkuntza sustatzen duen bakterio batean poliaminen sintesian parte hartzen duen gene bat ezabatzeak landareen hazkuntza sustatzeko eta estresarekiko erresistentzia eragiteko duen gaitasunean duen eraginari buruzko lehen txostena.
Beraz, proiektuak landare ez-leguminosoak eta PGP bakterioen arteko elkarrekintzei buruzko ezagutzan oinarritzen da, eta hori beharrezkoa da ongarri bakterianoen diseinu eraginkorragoa egiteko. Gainera, proiektuak Pseudomonas brassicacearum CDVBN10 anduiak koltza-laboreetarako bioongarri gisa duen potentzial handia erakusten du, eta horrek ongarri kimikoen erabilera murriztuko luke labore honetan, ingurumenean eta kontsumitzaileen osasunean eragin positibo nabarmena izango lukeelarik.
- UNIVERSIDAD DE SALAMANCA (USAL)
Lotutako proiektuak
